ปฏิบัติการที่ 5.1 การย้อมสีอย่างง่าย

 

วัตถุประสงค์

1.เพื่อสามารถเตรียมสไลด์ในการย้อมสีได้ถูกต้อง

2.เพื่อศึกษากลไกการย้อมสีแบคทีเรีย

3.เพื่อศึการูปร่างและการจัดเรียงตัวของเซลล์แบคทีเรีย

4. เพื่อเข้าใจจุดมุ่งหมายและข้อจำกัดของการย้อมสีอย่างง่าย

 

 

การเตรียมแบคทีเรียเพื่อย้อมสี

                                1.เตรียมสใลด์

                                สใลด์ที่ใช้เตรียมเชื้อแบคทีเรียอาจเป็นสใลด์ใหม่หรือที่ใช้แล้วก็ได้ แต่ต้องล้างให้สะอาดไม่มีฝุ่นหรือไขมันเกาะ การล้างสใลด์อาจล้างด้วยน้ำยาซักล้างทั่วๆไปก็ได้ และล้างด้วยน้ำสะอาดแล้วเช็ดให้แห้ง จากนั้นนำไปแช่ใน 95 % Ethyl alcohol นาน แล้วจึงเช็ดให้แห้งด้วยผ้าสะอาด เก็บไว้ในภาชนะที่ปิดสนิท การจับสใลด์ควรจับที่ขอบเพื่อไม่ให้คราบไขมันจากมือเปื้อนแผ่นสใลด์

                                2.การเตรียมเสมียร์เชื้อ

                                นำแบคทีเรียที่ต้องการย้อมสีมาป้ายลงบนแผ่นสใลด์แล้วเกลี่ยเชื้อให้กระจาย โดยใช้ลูป (loop) กระจายเชื้อบนสใลด์ให้ได้พื้นที่ประมาณ 1-2 ตารางเซนติเมตร

                                3.ตรึงสเมียร์เชื้อ

                                เป็นการทำให้เชื้อเสมียร์ติดแน่น (Fixation) บนสใลด์ก่อนที่จะทำการย้อมสี เพื่อไม่ให้เชื้อหลุดออกจากสใลด์ขณะที่ย้อมสีหรื ล้างสีออก และเป็นการทำลายเอมไซม์ในเซลล์หรือเพื่อป้องกันกรเกิด autolysis โดยทั่วไปมักตรึงเชื้อด้วยความร้อนโดยนำสเมียร์เชื้อที่แห้งแล้วไปผ่านไฟ 2-3 ครั้ง แต่ไม่ควรลนไฟนานจนเกินความจำเป็นเพราะอาจทำให้เซลล์เปลี่ยนรูปร่างได้

วัสดุ / อุปกรณ์

               1.เชื้อบริสุทธิ์ของ Staylococcus aureus จากหลอดวุ้นเอียง

                    2.เชื้อบริสุทธิ์  Bacillus cereus จากหลอดอาหารเหลว

                    3.สใลด์ เข้มเขี่ยเชื้อ (loop ,needle)

                    4.ตะเกียงแอลกอฮอล์

                    5.ถาดย้อมสีแกรม ไม้ตะเกียบและขัน

                    6.กล้องจุลทรรศน์

                    7.ขวดน้ำกลั่น Immersion oil

                    8.ชุดสีย้อมแกรม

 

 

 

 

ขั้นตอนการย้อมสีแบคทีเรีย

                    สำหรับการย้อมสีแบคทีเรียขั้นตอน ดังนี้

                                1.หยดน้ำกลั่นปลอดเชื้อลงบนสใลด์ ประมาณ 1 หยด

                                2. ใช้ลูป (loop) แตะเชื้อจากหลอดอาอาหารเลี้ยงเชื้อที่เตรียมไว้

                                3.เกลี่ยเชื้อ (Smear) บนสใลด์ให้กระจายเป็นแผ่นฟิล์มบางๆไม่ให้หนาแน่นมากจนเกินไปและปล่อยให้แห้งในอากาศ (air dry)

                                4.ตรึงเชื้อ (Fix) ให้ติดแน่นกับสใลด์ ซึ่งจะทำให้เชื้อไม่หลุดออกขณะย้อมสี การตรึงเชื้อทำได้โดยการนำสใลด์ที่เกลี่ยเชื้อทิ้งไว้จนแห้งแล้วไปผ่านไปอย่างรวดเร็ว 2-3 ครั้ง

                                5.หยดสี คริสตอลไวโอเลต (Crystal violet) บริเวณที่เกลี่ยเชื้อให้ท่วม ทิ้งไว้ 1 นาที แล้วเททิ้ง

                                6.ล้างสีออกเบาๆด้วยน้ำกลั่น  ใช้กระดาษเช็ดเบาๆและตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์

                                7.ตรวจสอบเชื้อทั้ง 2 ชนิด สังเกตความแตกต่างในเรื่องขนาดรูปร่าง  และการจัดเรียงตัวของเซลล์

รายงานผลการทดลอง

วาดภาพและบรรยายรูปภาพ การจัดเรียงตัวของเซลล์พร้อมบันทึกผล

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

สรุปผลการทดลอง

 

 

 

คำถามท้ายบท

1.การย้อมสีอย่างง่ายมีประโยชน์อย่างไร

ตอบ  ทำให้ทราบรูปร่างและขนาดของเซลล์และการจัดเรียงตัว

2.การย้อมสีอย่างง่ายสามารถใช้สีอะไรได้บ้าง

ตอบ สีคริสตัลไวโอเลตเพียงสีเดียว

3.ถ้าไม่นำสไลด์ทีสเมีนร์เชื้อแล้วไปฟิกซ์ด้วยความร้อน จะเป็นอย่างไร

ตอบ เชื้อจะเลื่อนออกจากสไลด์หรือไม่ติดสไลด์

4.แบคทีเรียติดสีย้อมได้อย่างไร

ตอบ เกิดจากแรงดึงดูดระหว่างพันธะของแบคทีเรียยึดเกาะกับสี

 

เอกสารอ้างอิง

-สืบค้นเมื่อวันที่ 4 ก.ค. 2554.อ.ดร.น้ำผึ้ง ดุงโคกกรวด.ปฏิบัติการจุลชีววิทยาสำหรับงานสาธารณสุข.มหาสารคาม; หลักสูตรสาธารสุขศาตร์,มหาวิทยาลัยมหาสารคาม;2554

-สืบค้นเมื่อวันที่ 4 ก.ค. 2554.วันเพ็ญ ภูติจันทร์. คู่มือปฏิบัติการพฤกษศาสตร์.อุบลราชธานี:โปรแกรมวิชาชีววิทยา,คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี, สถาบันราชภัฏอุบลราชธานี : 2543