การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช(Plant  Tissue  Culture)
ประวัติการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช               
                การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเริ่มต้นในปี ค.ศ.1902  โดย Haberlandt  นักวิทยาศาสตร์ชาวเยอรมันได้ทำการแยกเซลล์พืชมาเลี้ยง  เพื่อจะทำการศึกษาคุณสมบัติของเซลล์  แต่ยังไม่ประสบผลสำเร็จจนถึงระดับเซลล์มีการแบ่งตัว  เพียงแต่พบว่าเซลล์มีการขยายขนาดขึ้นเท่านั้น  ในปี ค.ศ.1930  ได้มีการพัฒนาการเลี้ยงเซลล์ที่แยกมาจากรากของพืชหลายชนิดโดยเลี้ยงในสภาพปลอดเชื้อ  ต่อมาในปี ค.ศ. 1938  สามารถเพาะเลี้ยงอวัยวะ( Organ ) และ แคลลัส ( Callus ) ของพืชได้หลายชนิดและนับตั้งแต่นั้นเป็นต้นมา  เทคโนโลยี การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชได้มีการพัฒนาไปได้อย่างกว้างขวาง และมีการค้นพบเทคนิคใหม่ๆอีกมากมาย ซึ่งสามารถทำการเพาะเลี้ยงพืชเซลล์เดี่ยวๆและโปรโตพลาสต์ของพืชได้หลายชนิด  รวมทั้งการใช้เทคนิคทางเทคโนโลยีชีวภาพ เช่น การตัดต่อยีนส์  การถ่ายยีนส์ ฯลฯ เทคนิค การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจึงมีบทบาทสำคัญต่อวิทยาการแขนงอื่นๆ เช่น ชีวเคมี  พันธุศาสตร์  การปรับปรุงพันธุ์พืช  โรคพืช  และเภสัชศาสตร์ เป็นต้น
ความหมาย
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช เป็นวิธีการขยายพันธุ์พืชแบบไม่ใช้เพศวิธีหนึ่ง ปฏิบัติภายใต้
สภาพที่ควบคุม เรื่องความสะอาดแบบปลอดเชื้อ อุณหภูมิและแสง ด้วยการนำชิ้นส่วนของพืชที่ยัง
มีชีวิต เช่น ลำต้น ยอด ตาข้าง ก้านช่อดอก ใบ ก้านใบ อับละอองเกสร ฯลฯ มาเพาะเลี้ยงบนอาหาร
สังเคราะห์ และชิ้นส่วนนั้นสามารถเจริญและพัฒนาเป็นต้นพืชที่สมบูรณ์มีทั้งส่วนใบ ลำต้น และ
รากสามารถนำออกไปปลูกในสภาพธรรมชาติได้
ที่ผ่านมามีการนำเทคนิคการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชประยุกต์ใช้กับด้านเภสัชวิทยา และ
ชีววิทยา แต่ปัจจุบันมีการพัฒนา และนำมาใช้แก้ปัญหา หรือเพื่อประโยชน์ในทางด้านภาคเกษตร
และอุตสาหกรรมกันมากขึ้น เช่น ด้วยการนำเมล็ดไผ่มาผลิต ขยายด้วยวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่ออีก
ด้วย เป็นต้น
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คืออะไร             
                คือการนำเอาส่วนใดส่วนหนึ่งของพืช เช่น อวัยวะ  เนื้อเยื่อ  และเซลล์มาเลี้ยงในอาหารสังเคราะห์  ซึ่งประกอบด้วยแร่ธาตุ  น้ำตาล  ไวตามินและสารควบคลุมการเจริญเติบโต  ในสภาพปลอดเชื้อจุลินทรีย์  โดยมีการควบคุมสภาพแวดล้อม  เช่น อุณหภูมิ  แสง และความชื้น  ส่วนต่างๆของพืชเหล่านี้จะสามารถเจริญเติบโตเป็นต้นใหม่  โดยอาศัยคุณสมบัติพิเศษของเซลล์พืชที่สามรถเจริญเติบโต  พัฒนาไปเป็นต้นใหม่ได้ หรือที่เรียกว่า โคลนนิ่ง
ประโยชน์การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
ปัจจุบันนี้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชมีบทบาทอย่างมากทั้งในด้านการเกษตรกรรม อุตสาหกรรม และด้านการแพทย์ ด้วยเหตุนี้จึงขอกล่าวถึงประโยชน์ของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชเป็นข้อ ๆ ดังนี้
เพื่อการขยายพันธุ์ โดยอาศัยอาหารสูตรที่สามารถเพิ่มจำนวนต้นเป็นทวีคูณจากไดอะแกรมประกอบ จะเห็นว่าจากที่เราเริ่มต้นทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อต้นพืชเพียงต้นเดียว และทำการย้ายเนื้อเยื่อเดือนละครั้ง และแต่ละเดือนต้นพืชสามารถเพิ่มจำนวนต้นได้ 10 ต้น เมื่อเวลาผ่านไปเพียง 6 เดือน เราสามารถผลิตต้นพืชในหลอดทดลองได้ถึง 1 ล้านต้น ซึ่งไม่มีวิธีอื่นใดที่จะ ผลิตต้นกล้าพืชให้ได้ปริมาณมากและรวดเร็วเช่นนี้
เพื่อการปรับปรุงพันธุ์  ในการเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช สามารถคัดเลือกสายพันธุ์พืช เพื่อการผลิตพืชพันธุ์ต้านทาน (resistant plant) สามารถที่จะชักนำให้เกิดความต้านทานขึ้นในต้นพืช โดยการเพาะเลี้ยงในอาหารที่มีเงื่อนไขต่าง ๆ เช่น การสร้างพันธุ์ต้านทานต่อสารพิษของโรค ต้านทานต่อแมลง หรือต้านทานต่อยากำจัดวัชพืช เป็นต้น หรือเพื่อการผลิตพืชพันธุ์ทนทาน (tolerance plant) ในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชสามารถที่จะคัดสายพันธุ์ทนทานได้จากการจัด เงื่อนไขของอาหารและสภาวะแวดล้อม เช่น การคัดเลือกสายพันธุ์พืชทนเค็มจากการเลี้ยงเนื้อเยื่อในอาหารที่มีส่วนผสม ของเกลือ การคัดเลือกสายพันธุ์ทนต่อดินเปรี้ยวจากการเลี้ยงในอาหารที่มีสภาพเป็นกรด การคัดสายพันธุ์ที่ทนร้อนโดยการเพาะเลี้ยงในสภาพที่มีอุณหภูมิสูง เป็นต้นโดยการชักนำให้เกิดการกลายพันธุ์ แล้วคัดเลือกเอาสายพันธุ์ดีไว้ ซึ่งอาจทำได้โดยการใช้สารเคมี การฉายรังสี การตัดต่อยีนส์ (DNA ricombination) และการย้ายยีนส์ (gene transformation) ยังเปิดโอกาศให้สามารถใช้ประโยชน์ในการสร้างพืชสายพันธุ์ใหม่ (transgenic plants) ที่ต้องการในพืชบางชนิด
                เพื่อการผลิตพืชที่ปราศเชื้อไวรัส (Virus-free plant propagation)  ปัญหาสำคัญประการหนึ่งของการผลิตพืช คือ โรค ซึ่งอาจมีสาเหตุมาจากเชื้อรา แบคทีเรีย หรือไวรัส ต้นพืชที่ผลิตได้จากการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะปราศจากเชื้อราและแบคทีเรีย เป็นอันดับแรก เพราะถ้าหากว่ามีอนุภาคของเชื้อเหล่านั้นตกลงไปในอาหารเลี้ยงเนื้อเยื่อ ก็จะแสดงอาการปนเปื้อนของเชื้อ (contamination) เพราะทั้งอนุภาคของแบคทีเรียและสปอร์ของราสามารถเจริญเติบโตได้อย่างรวด เร็วบนอาหารและจะปรากฎกลุ่ม colony ของจุลินทรีย์เหล่านั้น ที่สังเกตเห็นได้ด้วยตาเปล่า เราจึงสามารถเก็บออกมาขจัดทิ้งได้ ส่วนในกรณีของการปนเปื้อนของเชื้อไวรัส ซึ่งเป็นอนุภาคที่มีขนาดเล็กมาก และจะสามารถดำรงชีวิตอยู่ได้ก็ต่อเมื่ออาศัยอยู่ในเซลล์ชนิดอื่น ฉะนั้นต้นพืชที่มีการปนเปื้อนของเชื้อไวรัสจึงไม่แสดงอาการปนเปื้อนให้เห็น สามารถทราบได้ก็ต่อเมื่อเกิดอาการบนต้นพืช ดังนั้นก่อนทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อจะต้องคัดเลือกและตรวจสอบเนื้อเยื่อ ชิ้นส่วนของพืชที่นับว่ามีความปลอดจากเชื้อไวรัสมากที่สุด คือ apical meristem ซึ่งเป็นเนื้อเยื่อเจริญที่อยู่บริเวณปลายยอดของลำต้น และเนื้อเยื่อของคัพภะ (embryo) ที่อยู่ในเมล็ด อันเนื่องจากอนุภาคของไวรัสสามารถเคลื่อนย้ายได้ทางท่ออาหาร (phloem) และ ท่อน้ำ (xylem) แต่เนื้อเยื่อดังกล่าวไม่มีท่อน้ำและท่ออาหารที่จะติดต่อกับ ส่วนอื่น ๆ ของต้นพืช
                เพื่อการผลิตสารทุติยภูมิ (Secondary metabolite) พืชบางชนิดสามารถให้สารที่มีคุณสมบัติทางยา หรือมีประโยชน์ทางด้านอุตสาหกรรม แต่ในบางครั้งปริมาณเนื้อสารที่ต้องการมีอยู่ในปริมาณน้อยมาก จะต้องใช้ชิ้นส่วนพืชจำนวนมากนำมาสกัดแยก การเพาะเลี้ยงเซลล์หรือเนื้อเยื่อของพืชเหล่านั้น ในสภาพแวดล้อมและอาหารที่เหมาะสมก็อาจชักนำให้เกิดการสังเคราะห์สารที่เรา ต้องการได้มากขึ้น
                เพื่อการศึกษาทางชีวเคมีและสรีรวิทยาของพืช (Biochemical and Physiology study) ต้นพืชที่เลี้ยงในหลอดทดลองนั้นสามารถที่จะติดตามการพัฒนาและเปลี่ยนแปลงได้ง่ายและอย่างใกล้ชนิด เช่น การศึกษาการตอบสนองของเนื้อเยื่อพืชต่อยาฆ่าแมลง ยาปราบศัตรูพืช หรือต่อสารควบคุมการเจริญเติบโตของพืช และการควบคุมตัวแปรต่าง ๆ ในหลอดทดลองทำได้ง่ายได้กว่าแปลงทดลอง
                เพื่อการเก็บรักษาพันธุ์พืช (Germplasm conservation, gene bank) ปัจจุบันพืชพรรณหลายชนิดได้สูญพันธุ์ไปหรือกำลังจะสูญพันธุ์ไปอย่างน่าเป็นห่วง ซึ่งอาจมีสาเหตุมาจากการเปลี่ยนแปลงของสภาวะแวดล้อมหรือเกิดจากการทำลายของมนุษย์เอง ด้วยเหตุนี้นักเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชจึงได้พยายามคิดหาวิธีที่จะเก็บรักษาพืชพรรณต่าง ๆ ไว้ในหลอดทดลอง โดยการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อในอาหารที่มีส่วนผสมของสารชะลอการเจริญเติบโตบางชนิด หรือมีสารที่ทำให้เกิดความเครียดของน้ำขึ้นในหลอดทดลอง ทำให้พืชมีการเจริญเติบโตในอัตราที่ช้ามาก ๆ เพื่อเป็นการประหยัดแรงงาน เวลา และอาหารในการที่จะต้องทำการย้ายเนื้อเยื่อบ่อย ๆ จนกว่าเมื่อใดที่ต้องการจะเพิ่มปริมาณเนื้อเยื่อนั้นสามารถย้ายลงเลี้ยงในอาหารสูตรปกติของพืชชนิดนั้น ๆ อีกวิธีหนึ่งก็คือ การเก็บรักษาเนื้อเยื่อไว้ในไนโตรเจนเหลวที่ อุณหภูมิต่ำถึง -196 องศาเซลเซียส ในสภาพเช่นนี้เซลล์และเนื้อเยื่อจะคงสภาพและมีชีวิตอยู่ได้ยาวนาน
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชประกอบด้วยขั้นตอนสำคัญ 6 ขั้นตอน               
                1.การเตรียมอาหารสำหรับการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช  ซึ่งประกอบด้วย  สารกลุ่มอนินทรีย์ และสารกลุ่มอินทรีย์               
                2.การคัดเลือกเนื้อเยื่อพืช  การเลือกเนื้อเยื่อที่ดีได้ส่วนที่ถูกต้องจะทำให้เกิดการฟอกฆ่าเชื้อและการชักนำให้เกิดต้นประสบความสำเร็จสูง
                3.การฟอกฆ่าเชื้อ  เป็นการทำให้ชิ้นส่วนของพืชปลอดเชื้อ  โดยการใช้สารเคมี  ได้แก่ยาระงับเชื้อ และยาทำลายเชื้อ  ซึ่งจะทำหน้าที่ให้ส่วนประกอบที่สำคัญของจุลินทรีย์เสียไป ก่อนที่จะนำมาเพาะเลี้ยงในอาหาร
                4.การขยายพันธุ์เพิ่มจำนวน ต้นพืชที่ได้จากการชักนำให้เกิดต้นจะมีความเยาว์วัย                  ( juveniliti ) สามารถที่จะชักนำให้เกิดต้นจำนวนมากได้ง่าย  โดยทำการเพาะเลี้ยงในอาหารที่มีสารควบคุมการเจริญเติบโตกลุ่มไซโตไคนิน
                5.การชักนำรากพืช  ต้นพืชที่ได้จากการเพิ่มจำนวนต้นสามารถชักนำให้เกิดรากในอาหารที่มีสารควบคุมการเจริญเติบโตกลุ่มออกซิน  ซึ่งจะส่งเสริมการเกิดรากและยับยั้งการเกิดยอด6.การย้ายออกปลูก  ซึ่งต้องการปรับสภาพของต้นพืชให้คุ้นเคยกับสภาพแวดล้อมภายนอกประมาณ 2-4 สัปดาห์  จะทำให้ลดเปอร์เซนต์ของการตายของต้นพืชเนื่องจากการย้ายปลูก 
                การที่จะทำการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชให้ได้ผลนั้น ขั้นแรกต้องฆ่าเชื้อห้องปฏิบัติการ เพราะการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืชนี้เป็นการเลี้ยงในสภาพที่ปลอดเชื้อ ห้องปฏิบัติการและเครื่องมือทุกอย่างต้องปลอดเชื้อจุลินทรีย์ เพราะจุลินทรีย์เป็นศัตรูตัวฉกาจที่จะทำให้การทำงานของเรามีปัญหาที่สุด และนอกจากฆ่าเชื้อห้องและอุปกรณ์แล้วชิ้นส่วนพืชที่จะนำมาขยายพันธุ์ต้องทำ การฆ่าเชื้อด้วย เรียกว่า วิธีฟอกฆ่าเชื้อ ขั้นตอนในการทำก็คือ
                1. เลือกชิ้นส่วนพืชที่อยู่ในช่วงเจริญเติบโต เช่น ยอดอ่อน เมล็ด ตาข้าง ปลายราก แล้วแต่ชนิดของพืชนั้น ๆ
                2. นำชิ้นส่วนนั้นมาตัดเป็นเป็นท่อนให้ส่วนข้อที่จะออกรากควรอยู่ตรงกลาง หรือถ้าเป็นเมล็ดควรทำความสะอาดแต่ถ้าเมล็ดนั้นแข็งควรนำไปแช่น้ำอุ่นสัก 1 คืน
              3. เตรียมน้ำปริมาณขวดละ 90 ml นำไปนึ่งฆ่าเชื้อที่อุณหภูมิ 121  ํC เป็นเวลา 15 นาที
             4. เมื่อได้น้ำที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว ตวง Chlorox ปริมาณ 10-15 ml  หยด Tween ประมาณ 2-3 หยด ถ้าเป็นพืชที่ค่อนข้างสกปรกใส่ยาฆ่าเชื้อ (Anti biotic) ด้วย
              5. นำชิ้นส่วนที่ล้างสะอาดแล้ว ใส่ลงไปในขวด แล้วเขย่าประมาณ 15 นาที
               6. หลังจากเขย่าครบ 10-15 นาทีแล้ว ล้างด้วยน้ำกลั่น 3 ครั้ง ครั้งละ 15 นาที แต่ควรทำภายใต้สภาพปลอดเชื้อ
              7. หลังจากทำการฟอกฆ่าเชื้อแล้ว นำชิ้นส่วนลงปลูกในขวดอาหารที่เตรียมไว้
ปัจจัยที่มีผลในการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
                ปัจจัยสำ คัญที่มีผลต่อความสำ เร็จของการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช คือ อาหารเพาะเลี้ยง ชิ้นส่วนของพืชที่นำ มาเพาะเลี้ยง และสภาวะที่ใช้ในการเพาะเลี้ยง โดยอาหารเพาะเลี้ยงนั้นเป็นปัจจัยที่สำ คัญอย่างยิ่งต่อความสำเร็จในการเพาะเลี้ยง อาหารเพาะเลี้ยงมีมากมายหลายสูตรให้เลือกใช้งาน เช่น สูตร Murashige andSkoog (MS) เป็นสูตรพื้นฐานที่นิยมใช้กับพืชทั่วๆ ไป สูตร Vacin and Went เหมาะสำ หรับการเพาะเลี้ยงกล้วยไม้สกุลต่างๆ สูตร Woody Plant Medium (WPM) เหมาะสำ หรับการเพาะเลี้ยงพืชพวกไม้เนื้อแข็งโดยทั่วไปสูตรอาหารเหล่านี้จะประกอบไปด้วย ธาตุอาหารหลักที่พืชต้องการในปริมาณมาก ได้แก่ ไนโตรเจน (N) ฟอสฟอรัส (P) โพแตสเซียม (K) ธาตุอาหารรองที่พืชต้องการในปริมาณเพียงเล็กน้อย เช่น โบรอน(B) โมลิบดินัม(Mo) แมงกานีส(Mn) โคบอลต์(Co) สังกะสี(Zn) ทองแดง(Cu) ไอโอดีน(I) และธาตุอาหารอื่นๆ เช่น วิตามิน กรดอะมิโน และนํ้าตาล นอกจากนี้อาจจะมีส่วนประกอบอื่นๆ เช่น สาร ควบคุมการเจริญเติบโตของพืช หรือที่เรียกว่าฮอร์โมนพืช หรือสารจากธรรมชาติอื่นๆ เช่น นํ้ามะพร้าว มัน
ฝรั่ง กล้วยหอม สารสกัดจากยีสต์ ซึ่งจะมีสารช่วยเร่งการเจริญเติบโตของพืชรวมอยู่ด้วย
ประเภทของอาหารเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช
                1. อาหารกึ่งแข็ง (semi-solid medium) เทคนิคที่ใช้ในยุคแรก ๆ นั้น ใช้วุ้น (agar) เพื่อปรับสารละลายอาหารให้มีสภาพเป็นของแข็งมากขึ้น โดยนึ่งใน หม้อนึ่งความดันเพื่อหลอมล.ะลายอาหารแล้วเทใส่ภาชนะและทิ้งให้แข็งตัวอยู่ในสภาพ อาหารกึ่งแข็ง แต่มักพบว่าคุณสมบัติต่าง ๆ ของสารประกอบเคมีในอาหารอาจไม่ได้รับสูงสุดเท่ากับอาหารเหลว (liquid medium) กระนั้นก็ตามวุ้นยังคงถูกนำมาใช้แต่จำเป็นต้องดัดแปลงให้เหมาะสม และต้องแน่ใจว่ามีความบริสุทธิ์จริง ๆ ในทางปฏิบัติแนะนำให้ล้างด้วยน้ำกลั่นบริสุทธิ์อย่างน้อย 3 ครั้ง รายงานว่าการเจริญเติบโตของถั่ว Pea abies จะดีที่สุดในอาหารแข็งที่ใช้วุ้น Difco Purified agar ขณะที่ Difco Noble agar ซึ่งผ่านการฟอกใสมากกว่าจะให้ผลที่ไม่ดีเท่า และการใช้วุ้นปริมาณมากเกินไปอาจไปยับยั้งการเจริญเติบโตของเนื้อเยื่อได้ ดังนั้นความเข้มข้นของวุ้นที่พอเหมาะสำหรับอาหารแต่ละชนิดจะต้องมีการทดสอบเสียก่อน อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นที่ใช้กันแพร่หลายและได้ผลดีเพื่อวัตถุประสงค์ส่วนใหญ่ คือ 0.8 % สารสังเคราะห์พวก gelatin และ silica gel ได้เคยมีการใช้ และในปัจจุบันมี การพัฒนาสารประกอบพวก acrylamide gels เช่นเดียวกับ starch co-polymers ก็มีการแนะนำมาใช้แทนวุ้น สารเหล่านี้มีข้อดีที่ไม่จำเป็นต้องต้มให้เดือดเพื่อช่วยให้ละลายน้ำได้ แต่ยังมีปัญหาในเรื่องการปรับค่า pH ในขณะที่สารพวกผงถ่าน (charcoal) ถูกเติมในอาหารหลายสูตร เพื่อช่วยกระตุ้นการเจริญเติบโตเนื่องจากสามารถดูดซับสารพิษพวก toxic metabolites ที่เกิดจากเนื้อเยื่อพืชที่เลี้ยงได้ดี
                2. อาหารเหลว (liquid medium) อาหารเหลวเป็นที่นิยมใช้อย่างกว้างขวาง เนื่องจากเนื้อเยื่อจะจมหรือแขวนลอยอยู่บนกระดาษกรองที่จุ่มในอาหารเหลว ตลอดเวลา ในทางปฏิบัติอาจาใช้ glass wool ช่วยพยุงเนื้อเยื่อที่เลี้ยงได้เช่นกัน เช่นเดียวกับการใช้ fabric support (100 % polyester) ที่อิ่มตัวด้วยอาหารเหลว ซึ่งจะช่วยในการเจริญเติบโตและการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานเกิดได้ดีขึ้น เนื้อเยื่อที่จมอยู่ในอาหารเหลวอาจถูกคนที่ความเร็ว 1 - 150 รอบต่อนาที (rpm) เพื่อช่วยในการหายใจ
อ้างอิง “ เข้าถึงได้จาก”http://ittm.dtam.moph.go.th/data_all/articles/article27.htm เมิ่อวันที่                                                          17 ธันวาคม 2553
                “เข้าถึงได้จาก”http://gotoknow.org/blog/tissuecultur เมิ่อวันที่ 17 ธันวาคม 2553