เทคนิคการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อและการทำให้ปราศจากเชื้อ

( Culture  medium  and  sterilization Technique) 

 

วิรุธน์  บัวงาม

               นักวิทยาศาสตร์  วิทยาลัยแพทย์แผนไทยและแพทย์ทางเลือ

มหาวิทยาลัยราชภัฏอุบลราชธานี

 

บทนำ

   อาหารเลี้ยงเชื้อ (culture  medium) คือ ส่วนประกอบของสารอาหารที่เอื้ออำนวยให้จุลินทรีย์เจริญและแบ่งเซลล์เพิ่มจำนวน  ซึ่งอาหารเลี้ยงเชื้อโดยทั่วไปควรมีคุณสมบัติดังนี้

          1. มีธาตุอาหารและความเข้มข้นที่เหมาะสมกับการเจริญของจุลินทรีย์

          2. มีความเป็นกรดและด่าง ( พีเอช ) เหมาะสมกับการเจริญ

          3. ปราศจากสารพิษที่มีผลต่อการเจริญ

          4. ปราศจากสิ่งมีชีวิตชนิดใด ๆ ในอาหารเลี้ยงเชื้อนั้น

            จุลินทรีย์แต่ละชนิดมีความต้องการธาตุอาหารตลอดจนพีเอชที่แตกต่างกัน ดังนั้นการเลือกใช้อาหารเลี้ยงเชื้อ  จึงต่างกันไปตามความต้องการของจุลินทรีย์และวัตถุประสงค์ของการใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้ในงานทางจุลชีววิทยามีหลายลักษณะ  เช่น  อาหารเหลว ( broth ) อาหารแข็ง (solid medium) โดยการเติมวุ้น 1.5 2.0 % ถ้าอาหารแข็งบรรจุในหลอดทดสอบและทำให้แข็งในลักษณะที่เอียงเป็นแนวลาด เรียก slant agar  แต่ถ้าแข็งในลักษณะหลอดทอสอบตั้งตรง เรียก deep  tube  agar แต่ถ้าบรรจุในจานเพาะเชื้อ (Petri dish) รียก  plate  agar นอกจากนี้ยังมีอาหารลักษณะกึ่งแข็ง(semi – solid) ที่เติมวุ้นเพียง 0.3 0.5 % เพื่อใช้ในการทดสอบการเคลื่อนที่ของแบคทีเรีย

 

อาหารเลี้ยงเชื้อสามารถจำแนกได้เป็น  2  ประเภท

            1.อาหารเลี้ยงเชื้อที่จำแนกตามองค์ประกอบของอาหาร

                   1.1 Complete medium หรือ Non – synthetic medium เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่ทราบส่วนประกอบทางเคมีที่แน่นอนทั้งชนิดและปริมาณ  อาหารเลี้ยงเชื้อนี้จะมีสารอินทรีย์มากมายที่ได้จากสารสกัดจากเนื้อเยื่อพืช หรือ สัตว์  เช่น peptone  yeast extract beef  extract หรือ malt extract  เป็นต้น  อาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้จึงช่วยในการเจริญของจุลินทรีย์ได้หลายชนิด อาหารเลี้ยงเชื้อที่จัดอยู่ในกลุ่มนี้ได้แก่ nutrient broth (NB) nutrient agar (NA) potato  dextrose agar (PDA) หรือ trypticase soy broth เป็นต้น

                   1.2 Chemically defined medium หรือ Synthetic medium เป็นอาหารสังเคราะห์ที่ทราบองค์ประกอบทางเคมีที่แน่นอน ดังนั้นในการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อชนิดนี้แต่ละครั้ง จะได้อาหารที่มีองค์ประกอบเหมือนกันทุกครั้ง  เช่น minimal medium ที่ประกอบด้วย กลูโคส 2.0 กรัม ( NH4)2SO4 1.0 กรัม  K2HPO4  0.7  กรัม  MgSO4 0.5 กรัม  agar  15.0 กรัม และน้ำกลั่น  1000  มิลลิลิตร

            2. อาหารเลี้ยงเชื้อที่จำแนกตามลักษณะการใช้งาน

                   2.1 Enriched   medium   เป็นอาหารลี้ยงเชื้อที่ใช้เพื่อเพิ่มปริมาณเซลล์จุลินทรีย์ที่ต้องการ   ซึ่งมีปริมาณเซลล์อยู่น้อยในตัวอย่างธรรมชาติให้มีจำนวนเพิ่มมากขึ้นในอาหาร โดยการเติมสารอาหารที่เอื้อต่อการเจริญของจุลินทรีย์ชนิดนั้น ๆ   เป็นพิเศษ  ซึ่งจะทำให้การแยกเชื้อชนอดที่ต้องการได้ง่ายขึ้น  ส่วนใหญ่นิยมใช้ในรูปของอาหารเหลว

                   2.2 Selective  medium  เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้เพื่อการคัดเลือกจุลินทรีย์ชนิดที่ต้องการให้เจริญได้เท่านั้น   โดยการเติมสารอาหารที่จุลินทรีย์ต้องการ   สามารถใช้ได้ดี  ในขณะที่จุลินทรีย์อื่นไม่สามารถใช้ได้   หรือการเติมสารยับยั้งการเจริญของจุลินทรีย์ชนิดอื่น ๆ อาหารกลุ่มนี้โดยส่วนใหญ่นิยมใช้ในรูปของอาหารแข็ง

                   2.3  Differential  medium  เป็นอาหารเลี้ยงเชื้อที่ใช้แยกชนิดของจุลินทรีย์  โดยอาศัยลักษณะที่แตกต่างกันของจุลินทรีย์ เมื่อเจริญบนอาหารที่มีอินดิเคเตอร์ (indicator) เช่น การใช้อาหารวุ้นที่เติมเลือด (blood agar medium) ในการแยกแบคทีเรียที่มีความสามารถในการย่อยสลายเม็ดเลือดแดง (haemolysis) แบคทีเรียที่ย่อยสลายเม็ดเลือดแดงได้จะเกิดบริเวณใส  (clear zone) รอบโคโลนี

            อาหารเลี้ยงเชื้อบางชนิดจัดอยู่ในกลุ่ม selective / differential  medium เช่น MacConkey  agar  ที่มีการเติมเกลือน้ำดี (bile salt) เป็นตัวคัดเลือก (selective agent) โดยเกลือน้ำดีมีผลยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมบวก (Gram – positive  bacteria) แต่ไม่ยับยั้งการเจริญของแบคทีเรียแกรมลบ (Gram - negative  bacteria) เช่น Escherichia coli. Emerobacier sp.,Salmonellasp. และ Proteus sp. อีกทั้งมีน้ำตาลกาแลกโตส และ neutral red ในอาหารเป็นอินดิเคเตอร์บอกความแตกต่าง  ( differential agent) ของจุลินทรีย์แกรมลบที่คัดเลือกได้  ซึ่งแบคทีเรียที่สามารถใช้น้ำตาลกาแลกโตสได้โคโลนีจะเป็นสีแดง เช่น  E.coli  ในขณะที่ Salmonella  sp. ซึ่งขาดความสามารถใช้น้ำตาลกาแลกโตสโคโลนีจะเป็นสีขาว

 

การกำจัดเชื้อ ( Sterilization )

            วิธีการทำให้อาหารเลี้ยงปราศจากสิ่งมีชีวิตใด ๆ สามารถทำได้โดย

                   1.การใช้ความร้อนชื้น ( moist  heat ) โดยใช้หม้อนึ่งความดันไอ ( autoclave ) ในการกำจัดเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อและภาชนะที่บรรจุ ในห้องปฏิบัติการนิยมใช้ที่อุณหภูมิ 121.5  องศาเซลเซียส  ความดันไอ 15 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว เป็นเวลา 15 30 นาที  ขึ้นอยู่กับปริมาณอาหารเลี้ยงเชื้อ  ซึ่งไอน้ำร้อนจะแทรกซึมเข้าสู่เซลล์และสปอร์ ทำให้โปรตีน (เอนไซม์) ต่าง ๆ ที่อยู่ภายในเซลล์เสียสภาพทางชีววิทยา

                   2.การใช้ความร้อนแห้ง (dry  heat)  โดยใช้ตู้อบ (hot–air oven) กำจัดเชื้อในเครื่องแก้วเครื่องมือเครื่องใช้ต่างๆ ที่เป็นวัสดุชนิดไม่เสื่อมสภาพได้ง่าย เช่น จานเพาะเชื้อ ปิเปต ขวด  รวมถึงสารเคมีที่เป็นผงบางชนิดที่สามารถทนความร้อนสูงได้ เช่น แป้ง การกำจัดเชื้อโดยวิธีการนี้ทำได้โดยอบที่อุณหภูมิ 180  องศาเซลเซียส  เวลา 1 2 ชั่วโมง วิธีการนี้จะทำให้เกิดการดึงน้ำออกจากเซลล์ (dehydrate) และเกิดการ oxidation ของสารต่างๆ ภายใน  protoplasm

                   3.การกรอง ( filtration ) โดยใช้เยื่อกรอง หรือแผ่นกรอง (membrane  filtration) ที่ทำจาก cellulose  acetate หรือ plastic  polymer ที่มีความหนาเพียง 0.1 มิลลิเมตร  ขนาดของรูเยื่อกรองตั้งแต่ 0.22 0.45  ไมโครเมตร  ซึ่งมีขนาดรูเล็กกว่าเซลล์จุลินทรีย์ วิธีการนี้นิยมใช้ในการแยกเชื้อจุลินทรีย์ออกจากอาหารเหลว หรือของเหลวที่สลายตัวได้ง่ายเมื่อถูกความร้อน เช่น ยาปฏิชีวนะ  ซีรั่ม สารละลายน้ำตาลบางชนิด การกำจัดเชื้อด้วยวิธีการนี้จุลินทรีย์ถูกแยกออกจากอาหารเหลว โดยเซลล์จุลินทรีย์จะติดอยู่บนเยื่อกรอง อาหารหรือของเหลวที่ผ่านการกรองแล้วจะปราศจากจุลินทรีย์ ดังนั้นจึงต้องเก็บในภาชนะที่ผ่านการกำจัดเชื้อ

 

การทดลองที่ 1 การเตรียมและการบรรจุอาหารเลี้ยงเชื้อ

วัตถุประสงค์

          1. เพื่อฝึกการเตรียมอาหารเลี้ยงเชื้อ  และกำจัดเชื้อในอาหารเลี้ยงเชื้อนั้นได้อย่างถูกต้อง

          2. สามารถกำจัดเชื้อในเครื่องแก้ว  เครื่องมือ  และอุปกรณ์ต่าง ๆ ที่ใช้ในงานทางจุลชีววิทยาได้อย่างถูกต้อง

 

อุปกรณ์และสารเคมี

          1.  ส่วนประกอบต่าง ๆ ของอาหาร  nutrient  broth ( NB)  , nutrient  agar (NA)  และ potato  dextrose  agar  (PDA)

          2. เครื่องชั่ง  กระดาษไขรองชั่ง  ( wax paper) ช้อนตักสาร ( spatula)

          3. ภาชนะเตรียมอาหาร  แท่งแก้ว  กระดาษวัดพีเอช  เครื่องมือช่วยกรอกอาหาร

          4. ขวดบรรจุอาหารฝาเกลียว

          5. สำลี กระดาษ ยางรัด ผ้าขาวบาง

          6. หม้อนึ่งความดันไอ (autoclave)

 

วิธีการทดลอง

          ก. การเตรียม  nutrient  broth

                   1. ชั่งส่วนประกอบต่าง ๆ ตามสูตรอาหารดังต่อไปนี้

                                  Beef  extract                      3      กรัม

                                  Peptone                            5      กรัม

                                  น้ำกลั่น                             1000  มิลลิลิตร

                   2. สารละลายส่วนประกอบต่าง ๆ ในน้ำกลั่น  คนด้วยแท่งแก้วให้ส่วนประกอบของอาหารละลาย  โดยใช้ความร้อนช่วย  แล้วปรับปริมาตรให้ครบตามสูตรด้วยน้ำกลั่น

                   3. วัดความเป็นกรดด่างด้วยกระดาษวัดพีเอช  ถ้าอาหารเป็นกรดหรือด่างมากเกินไปให้ปรับด้วยสารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์เข้มข้น 0.1 นอร์มอล  หรือสารละลายกรดไฮโดรคลอริกเข้มข้น 0.1 นอร์มอล   จนได้พีเอชประมาณ 7.0 

                   4. ในกรณีที่อาหารมีตะกอนหรือเศษผงให้กรองผ่านผ้าขาวบาง

         

          ข. การเตรียม  nutrient  agar 

                   1. ใช้ส่วนประกอบเช่นเดียวกับ NB แล้วเติมวุ้น  15 กรัม

                   2. ต้มพร้อมกับคนด้วยแท่งแก้วจนวุ้นละลายหมด ( อุณหภูมิประมาณ  97 100 องศาเซลเซียส)

                   3. ปรับปริมาตรให้ครบตามสูตรด้วยน้ำกลั่นและปรับพีเอชให้ได้ประมาณ7.0

 

          ค. การเตรียม potato dextrose agar 

                   1. สูตรอาหาร  PDA

                                      มันฝรั่ง                               200     กรัม

                                      เดกซ์โทรส                          20      กรัม

                                      วุ้น                                   15      กรัม

                                      น้ำกลั่น                              1000   มิลลิลิตร

                   2.ปอกเปลือกมันฝรั่ง  หั่นเนื้อมันฝรั่งเป็นชิ้นสี่เหลี่ยมลูกบาศก์ขนาดด้านละประมาณ 1 เซนติเมตร  ชั่งให้ได้น้ำหนักตามสูตร  แล้วต้มในน้ำกลั่น  500  มิลลิลิตร  จนเดือดนานประมาณ  10-15 นาที   อย่าทำให้เนื้อมันฝรั่งเละ   กรองเอาแต่น้ำโดยใช้ผ้าขาวบาง

                   3. ชั่งน้ำตาลเดกซ์โทรส  และวุ้นให้ได้น้ำหนักตามสูตร   ละลายในน้ำกลั่น  500  มิลลิลิตร  โดยใช้ความร้อนช่วยจนวุ้นละลายหมด

                   4. ผสมส่วนประกอบจากข้อ 2 และ ข้อ 3 เข้าด้วยกัน  ปรับปริมาตรด้วยน้ำกลั่นจนครบตามสูตร

 

            ง. การบรรจุอาหาร

                   1.บรรจุอาหารที่เตรียมเสร็จแล้วลงในหม้อกรอกอาหาร  กรอกอาหารใส่ขวดและหลอดทดสอบ  โดยบรรจุ 1 ใน 2 ส่วนของขวด  และ 1 ใน 4 ส่วนของขวด ( กรณีที่เป็นอาหารแข็งให้บรรจุในขณะที่อาหารยังร้อน) ระวังอย่าให้อาหารเปื้อนปากขวดหรือปากหลอด

                   2. ปิดขวดด้วยฝาเกลียวให้สนิทแล้วคลายเกลียวออกครึ่งรอบ  ( ภายหลังการนึ่งฆ่าเชื้อแล้วจึงปิดเกลียวให้แน่น) ปิดหลอดอาหารด้วยการอุดด้วยจุกสำลีที่แน่นพอสมควร  โดยนำสำลีที่ปริมาณเหมาะสมกับขนาดของหลอดทดสอบมาปั้นให้แน่นเป็นแท่งลักษณะทรงกระบอก ทดลองอุดและดึงจุกสำลีหลาย ๆ ครั้ง  จุกสำลีที่ดีจะยังคงรูปอยู่เหมือนเดิม ( ฝึกหัดเทคนิคปฏิบัติจากอาจารย์ผู้สอน)

                   3. หลังจากบรรจุอาหารเรียบร้อยแล้ว  แยกหลอดบรรจุอาหาร NB  NA และ PDA เก็บไว้อย่างละ 2  หลอด  รวบรวมขวดและหลอดอาหารใส่ตะกร้า  ปิดหุ้มด้วยกระดาษหนา ๆ เพื่อป้องกันไอน้ำหยดลงมาทำให้สำลีเปียก  นำไปกำจัดเชื้อด้วยหม้อนึ่งความดันไอ

                   4. ทำความสะอาดภาชนะ  และเครื่องมือต่าง ๆ ที่ใช้ในการเตรียมอาหารให้เรียบร้อย

 

เอกสารอ้างอิง

จริยา หาญวจนวงศ์ และคณะ. คู่มือปฏิบัติการจุลชีววิทยาทางการแพทย์ สำหรับนักศึกษาแพทย์ชั้นปีที่ 3, ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น : 2536

บัญญัติ  สุขศรีงาม. ชีววิทยาเบื้องต้นของเซลล์ .สำนักพิมพ์โอเดียนสโตร์. กรุงเทพฯ :2526

วันเพ็ญ ภูติจันทร์. คู่มือปฏิบัติการพฤกษศาสตร์.อุบลราชธานี:โปรแกรมวิชาชีววิทยา,คณะวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี, สถาบันราชภัฏอุบลราชธานี : 2543

อนันต์  ลือขจร. กล้องจุลทรรศน์และเทคนิคการถ่ายภาพทางชีววิทยา. สำนักพิมพ์โอเดียนสโตร์. กรุงเทพฯ :2536