เทคนิคการนับจำนวนเชื้อจุลินทรีย์

(Microbial Population Count)

 

วิรุธน์  บัวงาม

นักวิทยาศาสตร์  วิทยาลัยแพทย์แผนไทยและแพทย์ทางเลือก

 มหาวิทยาลัยราชภัฏอุบลราชธานี

 

บทนำ

             การนำจุลินทรีย์มาใช้ประโยชน์ในการผลิตทางอุตสาหกรรม ในการวิจัย  การควบคุมปริมาณจุลินทรีย์  การควบคุมคุณภาพน้ำและอาหาร  สิ่งหนึ่งที่นักจุลชีววิทยาจะต้องศึกษา คือ  การนับจำนวนจุลินทรีย์  การตรวจสอบจำนวนจุลินทรีย์ตั้งแต่จำนวนเซลล์เริ่มต้น และจำนวนเซลล์ระหว่างการเจริญในอาหารเลี้ยงเชื้อ  เซลล์ที่มีชีวิตและเซลล์ที่เจริญได้สามารถทำได้หลายวิธี ได้แก่

                     

1. การนับโดยตรง (direct count) เป็นการนับจำนวนโดยตรงจากกล้องจุลทรรศน์ มีหลายวิธี  คือ

                   1.1 การนับเชื้อแบคทีเรียที่ผ่านการตรึงและย้อมสี (stained film) วิธีนี้เป็นการนับเชื้อแบคทีเรีย ปริมาตร 0.01 มล. ที่ถูกตรึงและย้อมสีอยู่บนสไลด์ภายในพื้นที่ 1 ตร.ซม. วิธีนี้มีข้อดีตรงที่ทำง่าย รวดเร็ว ค่าใช้จ่ายในการวิเคราะห์ไม่แพง แต่มีข้อเสียตรงที่เป็นการนับจำนวนแบคทีเรียทั้งหมด (total count) ทั้งเซลล์ที่มีชีวิตและไม่มีชีวิต  นอกจากนี้ตัวอย่างที่จะตรวจนับต้องมีจำนวนเชื้อแบคทีเรียมาก

                   1.2 การนับเชื้อบนสไลด์ที่มี counting chamber  สไลด์ที่มี counting chamber ได้แก่

                         - Petroff – Hausser counting chamber) นิยมใช้นับจำนวนแบคทีเรีย

                         - Haemacytometer ใช้นับ eucaryotic microbe ที่มีขนาดใหญ่

             สไลด์พวกนี้จะมีแอ่ง (chamber) ซึ่งรู้ความลึกของ chamber  และที่พื้นของ chamber จะมีตารางสี่เหลี่ยมซึ่งทราบความกว้างความยาวของตารางสี่เหลี่ยม   ดังนั้นเมื่อหยดเชื้อจุลินทรีย์ลงไปใน chamber ที่มี cover glass ปิดอยู่  ตรวจนับเชื้อจุลินทรีย์ด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังขยาย 400X ในสี่เหลี่ยมลูกบาศก์เล็ก  ก็จะทำให้สามารถคำนวณหาจำนวนเซลล์ต่อมล.ของตัวอย่างได้ สำหรับข้อดีข้อเสียของ counting chamber จะเหมือนกับนับด้วยวิธี stained film

                         - การนับเชื้อจุลินทรีย์ใช้กำลังขยาย objective lens 40X  

                         - ถ้าเป็นเชื้อแบคทีเรียให้นับช่องที่มีความยาวด้านละ 0.05 มม. และควรเจือจางให้มีแบคทีเรีย 1-10 เซลในแต่ละช่องเล็ก  และนับไม่ต่ำกว่า 10 ช่อง  

                         - ถ้าเป็นยีสต์หรือจุลินทรีย์ขนาดใหญ่ให้ใช้ช่องใหญ่ที่มีความยาวด้านละ 0.2 มม.

                         - การนับให้นับเฉพาะเซลที่แตะหรือทับด้านบนหรือด้านขวาของสี่เหลี่ยมจตุรัสแต่จะไม่นับเซลใดก็ตามที่แตะหรือทับด้านล่างและทางซ้ายมือของสี่เหลี่ยมจตุรัส

 

2.การนับจำนวนเชื้อจุลินทรีย์ที่เพาะบนจานอาหาร (plate count)

              การนำอาหารเลี้ยงเชื้อที่ผสมวุ้น (agar media) มาใช้ตั้งแต่ปลายทศวรรษที่ 1800 ทำให้เกิดการพัฒนาวิธีการนับจำนวนจุลินทรีย์โดยการนับจำนวนโคโลนี  วิธีการดังกล่าวมีพื้นฐานจากข้อสมมติ 3 อย่าง คือ        

                     1.เซลล์จุลินทรีย์หนึ่งเซลล์เจริญและแบ่งตัวเพื่อสร้างโคโลนีเดี่ยว  

                     2.เชื้อจุลินทรีย์เริ่มต้น(original inoculum) มีลักษณะเป็นเนื้อเดียวกัน (homogeneous)

                   3. ไม่มีเซลล์ใดๆที่อยู่รวมกัน (no aggregate) วิธีนี้ทำง่ายนับจำนวนได้ดีแม้ว่าจะมีจำนวนเชื้อจุลินทรีย์ต่ำ (sensitive) และนิยมใช้กันอย่างกว้างขวางทั้งจากตัวอย่างอาหาร น้ำ และดิน 

              ในการนับเซลล์จุลินทรีย์ด้วยวิธีนี้จำนวนโคโลนีที่เจริญบนจานอาหารมีความสำคัญ คือ ต้องมีจำนวนไม่มากหรือน้อยเกินไป  โดยทั่วไปจะนับเฉพาะจานอาหารที่มีจำนวนเซลล์ระหว่าง 25-250 เซลล์เท่านั้น  ดังนั้นเพื่อให้จำนวนโคโลนีที่เจริญบนจานอาหารอยู่ในช่วงดังกล่าว ควรทำการเจือจางเชื้อเริ่มต้นหลายๆครั้ง  โดยทั่วไปทำเป็นลำดับๆละ 10 เท่า (serial dilution) แล้วทำการเพาะเชื้อ   จุลินทรีย์ที่แต่ละระดับการเจือจางลงบนจานอาหาร เมื่อเชื้อจุลินทรีย์เจริญบนจานอาหารแล้ว นับจำนวน   ทำการคำนวณหาจุลินทรีย์ต่อกรัมหรือมล.ของตัวอย่างได้ การรายงานผลมักรายงานเป็น colony forming unit (CFU) มากกว่าจำนวนจุลินทรีย์  เนื่องจากไม่สามารถบอกได้อย่างแน่นอน ชัดเจนว่า 1 โคโลนีมาจาก 1 เซลล์  การนับจำนวนด้วยวิธี plate count จึงเป็นการนับจำนวนเซลล์ที่มีชีวิต (viable count) ซึ่งมีหลายวิธี  ได้แก่


 2.1 Pour plate

                   เมื่อตัวอย่างถูกเจือจางลงระดับละ 10 เท่า   ทำการเพาะเชื้อจุลินทรีย์จากตัวอย่างที่มีระดับการเจือจางเหมาะสม  โดยใช้เชื้อจุลินทรีย์ 1 มล.หรือ 0.1 มล.หยดไปบนจานอาหารแล้วเทอาหารเลี้ยงเชื้อที่มีอุณหภูมิ 44 – 46 ๐ ซ ลงไป  ผสมเชื้อจุลินทรีย์กับให้เข้าอาหารโดยแกว่งจานอาหารไป-มาเบาๆ ทิ้งให้อาหารแข็งตัวแล้วนำไปบ่ม  ภายหลังบ่มแล้วโคโลนีของจุลินทรีย์จะเจริญทั้งในและบนอาหารเลี้ยงเชื้อ นับจำนวนจุลินทรีย์ในจานอาหารที่มีจำนวนเซลล์ 25-250 เซลล์   ก็จะทำให้สามารถคำนวณหาเชื้อจุลินทรีย์ต่อมล.หรือต่อกรัมตัวอย่างได้  วิธีนี้หากใช้วุ้นที่ร้อนไปอาจทำให้ sensitive cell ตายหรือบาดเจ็บไม่สามารถสร้างโคโลนีได้  

2.2 Spread plate

                   เป็นวิธีการนับจำนวนโคโลนีของจุลินทรีย์ที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ โดยใช้เชื้อจุลินทรีย์ 0.1 มลหยดลงบนจานอาหารที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อซึ่งแข็งตัวแล้ว (solidified agar medium)   เชื้อจุลินทรีย์จะถูกแผ่กระจายทั่วผิวหน้าอาหารเลี้ยงเชื้อด้วยแท่งแก้วพิเศษที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว (spreader)วิธีนี้ผู้วิเคราะห์จะสามารถสังเกตลักษณะโคโลนีของจุลินทรีย์ได้ง่าย  ในบางครั้งวิธี spread plate อาจนับปริมาณเซลล์ได้มากกว่าวิธี pour plate  เนื่องจากจุลินทรีย์ไม่ได้เจอกับความร้อนจากอาหารเลี้ยงเชื้อหลอมเหลวเหมือนวิธี pour plate    ในกรณีที่ตัวอย่างมีเซลล์  จุลินทรีย์อยู่น้อย  การใช้วิธีนี้อาจขาดความถูกต้องแม่นยำเนื่องจากใช้ปริมาณตัวอย่างค่อนข้างน้อย (0.1 มล.) ในการ plating

 

2.3 Drop plate

                   วิธีนี้มีหลักการเหมือนกันกับ spread plate  โดยจะหยดตัวอย่างที่ระดับการเจือจางที่เหมาะสมลงบนจานอาหารหนึ่งจานต่อ 5 จุด  โดยแต่ละจุดใช้ปริมาณ 0.02 มล. ตัวอย่างจะถูกปล่อยให้แห้งอยู่บนอาหารเลี้ยงเชื้อในจานอาหารซึ่งโดยปกติจะมีความยาวเส้นผ่านศูนย์กลางระหว่าง 1.5 ถึง 3 ซม. การนับและคำนวณจำนวนโคโลนีขึ้นอยู่กับจำนวนหยดต่อจานอาหาร  จำนวนหยดต่อมล. และค่าการเจือจาง (dilution factor)  โดยทั่วไปเมื่อบ่มจนเชื้อเจริญแล้ว  ให้เลือกจานอาหารที่มีระดับการเจือจางเหมาะสมคือ มีเชื้อจุลินทรีย์บนจานอาหารแต่ละจุดไม่เกิน 10 โคโลนี เมื่อนับจำนวนโคโลนีทั้ง 5 จุดรวมกันในแต่ละระดับการเจือจาง ก็จะสามารถคำนวณหาจำนวนเชื้อจุลินทรีย์ต่อมล.หรือต่อกรัมตัวอย่าง

2.4 Membrane filtration method

                   วิธีนี้เหมาะสำหรับตัวอย่างมีจำนวนจุลินทรีย์อยู่น้อยและจำเป็นต้องใช้ปริมาตรของตัวอย่างมากเพื่อความแม่นยำในการตรจหาจุลินทรีย์แบบปริมาณวิเคราะห์ (quantitative analyses)ตัวอย่าง 100 มล.หรือมากกว่าจะถูกกรองผ่าน membrane filter  ซึ่งมีรูขนาด 0.45 ไมครอน (แบคทีเรียไม่สามารถผ่านได้) ดังนั้นจุลินทรีย์จะถูกกักอยู่บนกระดาษกรอง จากนั้นนำกระดาษกรองวางในจานอาหารที่มีกระดาษซึ่งชุ่มด้วยอาหารเหลว (liquid nutrient medium) อยู่แล้ว  โคโลนีของจุลินทรีย์จะเจริญบนกระดาษกรอง วิธีนี้มักใช้กับการตรวจวิเคราะห์ coliform bacteria ซึ่งเป็นตัวบ่งชี้ (indicator) การปนเปื้อนจากอุจจาระในอาหาร หรือน้ำ 

 

เอกสารอ้างอิง

จริยา หาญวจนวงศ์ และคณะ. คู่มือปฏิบัติการจุลชีววิทยาทางการแพทย์ สำหรับนักศึกษาแพทย์ชั้นปีที่ 3, ภาควิชาจุลชีววิทยา คณะแพทย์ศาสตร์ มหาวิทยาลัยขอนแก่น : 2536

Adam, M.R. 1986. Process in Industrial Microbiology. Volume 23. Microorganisms in the Production of Food. Elsevier Science Publishers, B.V., The Netherlands.

AOAC International. 1998. Bacteriological Analytical Manual (BAM). 8th edition Revision A, Published and distributed by AOAC International, USA.